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一般通过测量叶绿素a来表示藻类的含量：实验14叶绿素a和b含量的测定(分光光度法)。1.目的学习叶绿素a和b含量的测定方法，了解叶片中叶绿素a和b的含量。二。材料、用具、仪器及药品菠菜叶、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶(25ml)、漏斗、滤纸、乙醇(95%) III。原理叶绿素A和B在波长上的最大吸收峰在665nm和649nm处，叶绿素A和B的比吸收系数K在该波长处是已知的，因此我们可以根据Lamb列表计算叶绿素A和B的比吸收系数，即浓度C与光密度D的关系：D649=83.31CA18.60CB2.04和9.27是叶绿素a和b在665nm波长处的比吸收系数。16.75和45.6是叶绿素a和b在649nm波长处的比吸收系数。如果你解方程(1)(2)，你会得到：CA=13.7D665—5.76D649四、四、四、五、六、六、六、六、六、六、六、七、六、六、七、八、九、九、九、九、九、八、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、九、方法步骤1。称取0.1g鲜叶，切成片，置于研钵中，加入10ml乙醇，研磨成匀浆，再加入5ml乙醇，过滤，最后用乙醇定容至25ml。2.取一个光学直径为1cm的比色杯，注入上述叶绿素乙醇溶液，在另一个同样规格的比色杯中加入乙醇。作为对照，在721分光光度计下，分别在665nm和649nm波长处测量颜料溶液的光密度。计算结果：叶绿素a含量(mg/g. FW)=叶绿素b含量(mg/g.FW)=总叶绿素含量(mg/g.FW)=见链接http://sky.scnu.e.cn/jpkc/zwslx/fenye/jakj/li/shi-yan/. 14.htm实验33(分光光度法)中也有叶绿素a和b含量的测定原理。如果混合溶液中两种组分的吸收峰明显不同，但吸收曲线相互重叠，在这种情况下，要分别测定两种组分，可以根据朗伯—比尔定律，用代数方法计算一种组分因另一种组分的存在而对吸光度的影响，最后分别得到两种组分的含量。9叶绿素a和b的吸收光谱曲线显示，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b的最大吸收峰在645nm，吸收曲线相互重叠。根据朗伯—比尔定律，最大吸收峰不同的两种组分混合物的浓度C与吸光度A之间存在如下关系(见实验86):A1=Ca ka1cb kb1(1)A2=Ca ka2cb kb2(2)其中：Ca为组分A的浓度，g/L. Cb为组分b的浓度，g/l. A1为混合溶液在波长1处的吸光度A值(即组分A的最大吸收峰波长)。A2为混合溶液在波长2处的吸光度A值(即组分B的最大吸收峰波长)。Ka1为组分A的比吸收系数，即组分A浓度为1g/L时组分A在波长1处的吸光度A值，Kb2为组分B的比吸收系数，即其浓度为1g/L时组分B在波长2处的吸光度A值，Ka2为组分A(浓度为1g/L)在波长2处的吸光度A值。Kb1是组分B(浓度为1g/L)在波长1处的吸光度A值。叶绿素A和B的80%丙酮溶液可以从文献中找到。浓度为1g/L时，比吸收系数K值如下：将表中数值代入上述公式(1)和(2)，整理后得到A663=82.04ca 9.27CBA 645=16.75ca 45.60CB。

63—0.002 69 A645Cb=0.022 9 A645—0.004 68 A663 如果把Ca，Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式：Ca=12.7A663—2.69A645 (3)Cb=22.9A645—4.68A663 (4)Ct=Ca+Cb=8.02A663+20.21A645 (5) (5)式中Ct为总叶绿素浓度，单位为mg/L。 利用上面(3)、(4)、(5)式，即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度。 注：一般大学教学实验室所用的分光光度计多为721型，属低级类型，其单色光的半波宽值要比中级类型的751型大得多，而叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm（663—645nm），难以达到精确测定。此外有时还由于仪器本身的标称波长与实际波长不符，测定的正确性就更差了。根据公式计算往往会得到叶绿素a∶b值小于1，这就不很奇怪了。除向学生说明其中原因外，还可以在实验前对仪器的波长进行校正，使标称波长与实际波长一致。校正可用纯的叶绿素a和b进行，分别在波长650—670nm和630梍650nm之间，每隔1—2nm测定叶绿素a或b的吸光度A，以确定叶绿素a和b的吸收峰的波长。如果测得的峰值与文献上的峰值663nm和645nm不同，可按照仪器说明书步骤进行校正，或者更方便的方法可以打开仪器盖子，松动波长刻度盘紧固螺丝，调节刻度盘使波长至正确值，而后旋紧螺丝复原仪器。 为校正仪器波长所需的叶绿素a和b的用量是很少的，用纸层析法很快就能分离制得。取植物叶子约1g，用乙醚提取叶绿体色素，再用毛细管将色素溶液画在3mm厚滤纸上使成一直线，为使分离效果好，一般重复点样一次即可。然后于密闭容器中进行上行层析，溶剂为含0.5%丙醇的石油醚。层析结束，用剪刀小心地剪下蓝绿色的叶绿素a和黄绿色的叶绿素b，注意剪时尽量避开有可能遭污染的色区。最后分别浸于80%丙酮中，洗下叶绿素a和bhttp://bio.biox.cn/Biology/200701/20070106230337_25343.shtml只是说测叶绿素a是常规的表示藻类总量的方法，也有些在线直接测藻类的仪器，你可以搜一下。